新稿速递耐二氧化硫乳酸菌的筛选鉴定及其在泡野山椒中的应用
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耐二氧化硫乳酸菌的筛选鉴定及其在泡野山椒中的应用
摘 要：筛选出2株源于泡蒜的耐SO2乳酸菌，对其形态学观察、生理生化测试及16S rDNA序列测定，菌株2-2被鉴定为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，菌株2-5为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。利用2株菌耐SO2特性，将其应用于野山椒泡制中，对含SO2的泡野山椒基础配方进行优化，结果表明：2株菌均在含SO2 150 mg/L的MRS培养基中能正常生长；将2菌株按1∶1的比例混合，以2%(v/w)的接种量接种至含SO2 75 mg/L，盐含量4%，蔗糖含量2%的野山椒中，室温发酵，成熟的泡野山椒酸咸适宜，色泽金黄、味道鲜美，具有泡野山椒典型的香气，为其工业生产提供了数据参考。
关键词：耐SO2；乳酸菌；泡野山椒；发酵
野山椒(Capsicum frutescensvar)俗称天椒、小米辣，果实呈米粒形或短指形，果皮主要为淡黄色、绿色，辣味浓郁[1]。野山椒经泡制发酵后，具有脆嫩芳香，辣中带酸、辣而不燥的特点，可增食欲、助消化、具有营养保健[2]的功效。泡野山椒的传统制作多以添加有机酸和SO2的化学法进行。对野山椒的护色需要添加一定量的SO2，SO2可杀死不耐受SO2的乳酸菌及其他微生物。也有采用自然发酵法，其发酵周期缓慢，甚至杂菌污染而发生“生花”、变软、褐变等现象，产品质量不稳定[3]。乳酸菌作为泡菜发酵的主要菌群，其具有发酵糖产酸，降低环境pH值，改善泡菜风味等功能[4]。随着泡菜工业化的发展，人工接种乳酸菌已成为现代发酵工业的新趋势。而目前关于利用乳酸菌发酵泡野山椒以改善泡椒品质的研究还鲜有报道。
有研究表明：泡菜色泽变化的主要原因有酶促褐变、维生素C氧化以及杂菌生长引起的变色等[5]。野山椒中Vc含量高，在发酵过程中易被氧化而引起变暗或变黑的现象[6]，严重影响产品外观、风味、营养价值，甚至商品价值。护色与防腐成为泡野山椒加工的一个关键环节。由于亚硫酸盐离子的亲核反应性，使其具有能广泛抑制褐变的功能[7]，对食品能够起到漂白、抑菌[8]、脱色和抗氧化[9]的作用。在泡野山椒生产中添加SO2或亚硫酸盐，对泡野山椒可以起到很好的护色作用，防止其褐变，使用低浓度的SO2不仅能达到理想效果减少残留，且能降低生产成本[10]。而SO2的抑杀菌作用会对泡野山椒中乳酸菌的生长发酵产生抑制效果，实际生产中往往出现泡野山椒自然发酵失败或为了防腐出现SO2残留超标的现象。为了能使泡野山椒产生良好的风味与色泽，采用接种耐受SO2的乳酸菌和添加SO2产生协同效应，因此，本试验以筛出耐SO2乳酸菌并将其应用于发酵野山椒中，优化泡野山椒的基础配方，为泡野山椒的工业化生产提供数据参考。
1 材料与方法
1.1 原料
野山椒购自四川省雅安市苍坪路农贸市场；食盐、蔗糖均为食品级，购自雅安市吉选超市。
1.2 菌株
乳酸菌株2-2和2-5分离于泡蒜；菌株8m-9(植物乳杆菌，Lactobacillus plantarum)、3m-1(肠膜明串珠菌，Leuconostoc mesenteroides)分离于什锦泡菜[11]；菌株6066分离于葡萄酒，为酒明串珠菌(Leuconostoc oenos)。由四川农业大学食品微生物实验室提供。
1.3 培养基
MRS培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，K2HPO42 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠5 g，葡萄糖20 g，吐温-80 2 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸馏水1 000 mL。pH 6.0～6.4，121 ℃灭菌15 min。
1.4 试剂
焦亚硫酸钠为食品级，市售。盐酸、乙酸铅、淀粉指示液、碘标准溶液、氢氧化钠标准滴定溶液、酚酞指示剂；乳酸菌生化鉴定管，青岛海博生物技术有限公司；溶菌酶(10 mg/mL)，北京天为时代科技有限公司；Taq酶、PCR反应试剂，宝生物工程(大连)有限公司；TIANGEN试剂盒(TIANamp Bacteria DNAkit 细菌基因组DNA提取试剂盒-离心柱型)，天根科技生化(北京)有限公司。
1.5 主要仪器
DHG-9162电热恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1F洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；SorvallST16R高速冷冻离心机，美国Thermo Fisher Scientific公司；PTC-200 PCR仪，美国Bio-Rad公司；CX21FS1光学显微镜，日本Olympus公司；pHS-4C+数显酸度计,成都世纪方舟科技有限公司；G154DW全自动高压灭菌锅，致微仪器有限公司。
1.6 方法
1.6.1 耐SO2乳酸菌的筛选
将4 ℃冰箱保存的斜面乳酸菌菌种，接种到MRS培养基活化培养后，以1%的接种量接种菌浓度为107 CFU/mL的菌液到SO2含量分别为0、50、100、150、200 mg/L的MRS培养基中，设定初始pH为5.5，37 ℃培养2 d，采用GB 4789.35—2010测定乳酸菌数,判断菌株耐受SO2的能力。
1.6.2 耐SO2乳酸菌的鉴定
1.6.2.1 菌株形态及生理生化鉴定
在形态特征观察的基础上，参照《乳酸菌鉴定及实验方法》和《伯杰氏系统细菌鉴定手册》，选择青岛海博生物技术有限公司的乳杆菌成套生化试剂进行鉴定。
1.6.2.2 16S rDNA的分子生物学鉴定
①将菌种接于10 mL MRS液体培养基，37 ℃静置培养24 h，收获菌体。按Bacterial DNAout抽提试剂盒使用手册提取菌株2-2、2-5的总DNA。
②16S rDNA的PCR扩增和序列测定：16S rDNA的通用引物为27F、1492R。PCR反应体系(25 μL)为：上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，模板DNA 1 μL，2×long Taq PCR MasterMix 12.5 μL(包括：0.1 U long Taq polymerase/μL，500 μmol/L dNTP each，20 mmol/L pH 8.3 Tris-HCl，3 mmol/L MgCl2)，超纯水9.5 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 1 min，66 ℃ 1 min，72 ℃20 s，循环30次；72 ℃延伸10 min。PCR产物由上海英潍捷基生物技术有限公司进行序列测定。
③序列分析：PCR产物序列通过BLAST在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB基因库中进行同源性比较和系统发育树构建[12]。
1.6.3 泡野山椒工艺配方优化
菌悬液、焦亚硫酸钠、食盐、蔗糖
↓
新鲜野山椒→去梗→清洗→沥干→装罐→密封→发酵
原料处理：选择大小均匀、淡黄色且新鲜的野山椒，剔除色深、已腐烂个体，去梗，清水清洗并沥干。
装罐：将冷开水注入罐中，加入焦亚硫酸钠溶液、食盐、蔗糖充分搅拌溶解后，并接种乳酸菌，按1∶1(w/v)的菜水比例，将野山椒码放于罐中，使其完全浸没于盐水中。
密封：盖好罐盖，避免空气及杂菌进入(以pH值降为3.5～3.6为发酵终点)。
1.6.3.1 发酵野山椒
在室温(日均最高、最低气温为25 ℃、15 ℃)下，选取接种混合乳酸菌(A：将筛选的耐SO2乳酸菌2-2∶2-5以1∶1混合接种)、焦亚硫酸钠(B)、食盐(C)、蔗糖(D)作为基础配方成分,参照文献[13]并在实验室研究基础之上设计4因素3水平正交试验，试验因素表见表1，以感官评分和总酸为评价指标，优化泡野山椒基础工艺配方。
表1 L9(34)正交试验因素水平表
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
1.6.3.2 检测指标
(1)总酸测定：根据GB/T12456—2008《食品中总酸的测定》中的规定，采用酸碱滴定法，以乳酸计。
(2)SO2残留测定L按照GB/T 5009.34—2003进行，采用直接滴定碘量法。
(3)乳酸菌数测定：平板计数法，参照GB 4789.35—2010测定。
(4)感官评价：参照文献[14]中发酵辣椒感官评分标准略改动，10人评价小组对产品的色泽、香气、滋味、质地进行感官评价，对应的评价得分集=[很差(2)，较差(4)，一般(6)，较好(8)，很好(10)]，评价结果用SPSS.19软件进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 菌株耐SO2能力的测定
将5株菌按照2%的接种量接种到初始pH5.5，SO2质量浓度分别为0、50、100、150、200 mg/L的MRS液体培养基中，37 ℃培养48 h，测定菌数，结果见表2。
表2 菌株在不同SO2浓度的发酵液中的生长情况
Table 2 In different strains of the sulfur dioxide content in fermented liquid fermentation results
一般情况下，细菌对SO2很敏感，SO2结合在被细胞膜束缚的ATP酶上，使细胞内ATP的丢失不受控制，从而影响细胞活性[6]，较低浓度的SO2对细菌都有一定的抑制或杀灭作用[15]。由表2可知，菌株6066、8m-9、3m-1的生长繁殖受到SO2的严重影响。无添加SO2培养条件下，从培养开始到结束，3株菌的菌量由105 CFU/mL上升到1010 CFU/mL，而在含SO250 mg/L的低浓度培养基中，培养2 d后的菌量为104或105 CFU/mL，与零添加培养比较，说明菌株在接种至含SO2的培养基后没有繁殖迹象甚至一部分已经死亡。随着SO2浓度的继续升高，菌株死亡增加，菌数迅速减少，当SO2浓度达到200 mg/L时，这3株菌活菌数几乎为零。菌株2-2、2-5虽然随SO2浓度的升高，菌数逐渐下降，但降幅远低于其余3株菌。当SO2浓度在50～150 mg/L区间内时，培养2 d后发现2菌株菌浓度均能达到107 CFU/mL以上，生长稳定，且在含200 mg/L SO2的培养基中，菌数还能基本维持在初始菌数范围内，因此认为菌株2-2、2-5为耐SO2的乳酸菌。菌株2-2、2-5均从大蒜泡菜水中筛得，试验选择这两株菌作为后续研究对象。
2.2 耐SO2乳酸菌的鉴定结果
菌株2-2、2-5在MRS培养基中培养48 h后的菌落及菌体形态见图1和图2。2菌株在改良MRS平板上的菌落形态为圆形、边缘整齐，表面光滑湿润，隆起，在含碳酸钙的MRS平板上均有溶钙圈，菌株2-5呈乳白色，而菌株2-2为浅白色，菌落较小；革兰氏染色镜检结果均为G+短杆菌。
图1 乳酸菌菌株2-2的细胞形态及菌落形态
Fig.1 Cell morphology and colony morphology of lactic bacteria 2-2
图2 乳酸菌菌株 2-5的细胞形态及菌落形态
Fig.2 Cell morphology and colony morphology of lactic bacteria 2-5
2.2.1 生理生化结果
菌株2-2、2-5的生理生化实验结果见表3，2菌株能发酵分解糖代谢，不还原硝酸盐，不液化明胶，接触酶和氧化酶皆呈阴性，结合形态特征和《乳酸菌分类鉴定及实验方法》初步判断菌株2-2和2-5属于乳杆菌属(Lactobacillus)。
2.2.2 分子生物学鉴定结果
采用16S rDNA序列同源性分析法对菌株2-2、2-5 进行分子生物学鉴定，以确定其分类地位。分别以2株菌的总DNA为模版，用细菌16S rDNA通用引物进行扩增，将得到的PCR产物送上海英潍捷基公司进行序列测定，2-2、2-5测序片段长分别为1444 bp、1433 bp，具有典型的16S rDNA的特征。将2菌株的16S rDNA序列输入GenBank，以Blast 软件进行序列同源性比较，结果显示：菌株2-2的16S rDNA基因序列与登录号为JN175331.1、KJ026616.1等发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)有100%相似性，在系统发育树上处于同一分支。菌株2-5的16S rDNA基因序列与登录号为KP862657.1、AJ965482.1等植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)相似性达100%。2菌株均与嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcusl actis subsp)近缘乳酸菌亲缘关系较远(图3)。因此，根据其亲缘关系，结合形态、生理生化鉴定结果确定2-2为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum 2-2)，2-5为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum 2-5)。
表3 菌株2-2、2-5的生理生化特征
Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain 2-2 and 2-5
注：“-”为阴性反应，“+”为阳性反应。
2.3 泡野山椒基础工艺配方的确定
由表5和表6结果显示，影响泡野山椒感官评价的主次顺序为A(接种量)>C(食盐添加量)>D(蔗糖添加量)>B(SO2添加量)，即对泡野山椒感官影响最大的因素为乳酸菌的接种量，SO2添加量对其品质影响最小，最优组合为A3B2C1D3。泡野山椒发酵产酸方面，最佳组合为A3B1C1D3，乳酸菌接种量和蔗糖添加量对泡野山椒产酸的影响较大，食盐添加量的影响次之，而SO2添加量的影响最小，这4个因素对泡野山椒产酸的影响都未达到显著水平。综合考虑各因素指标，选择最佳发酵条件：为A3B2C1D3，即接种量2%，SO2添加量75 mg/L，盐含量4%，蔗糖含量2%。
图3 菌株2-2、2-5基于16S rDNA的系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree of strain 2-2 and 2-5
按照以上所得最优发酵条件进行验证试验，结果证明，接种量2%，SO2添加量75 mg/L，盐含量4%，蔗糖含量2%，在室温(日均最高、最低气温为25 ℃、15 ℃)下发酵5 d后野山椒成熟，其总酸含量为1.05 g/100 mL，乳酸菌数为1.18×108CFU/mL，感官评分为8.86，泡山椒呈淡黄色、色泽鲜亮，口感酸咸适宜，香气浓厚。测得样品中SO2含量为11.2 mg/L，符合国家食品安全标准。
表4 正交试验结果
Table 4 Results of orthogonal experiment
表5 直观分析表
Table 5 Therange analysisof experiment results
表6 方差分析表
Table 6 Thevariance of experiment results
注：F0.05(2,9)= 4.26；F0.01(2,9)= 8.02。
3 结论与讨论
筛得2株对SO2具有较强耐受能力的乳酸菌，经系统鉴定为发酵乳杆菌2-2(Lactobacillus fermentum 2-2)、植物乳杆菌2-5(Lactobacillus plantarum 2-5)，它们在SO2添加量为150 mg/L培养基中均能正常生长。菌株2-2和2-5均来源于大蒜泡菜水，在蒜制品生产过程中，为使其保持鲜艳色泽和抑制微生物生长常使用亚硫酸盐[16],这可能是菌株2-2与2-5较其他来源乳酸菌耐SO2的原因。SO2对乳酸菌有强烈的抑制作用，并且低的pH值与SO2的抑制作用有协同效应，原因是SO2在水溶液中会呈现3种形式：游离态SO2、HSO3-、SO32-，其中游离态的SO2是唯一一种能够与食品中一些重要的风味及呈色化合物结合的形态[17]，酸性条件下结合态的SO2易转化成游离态的SO2，从而增大了游离态SO2浓度，对乳酸菌造成毒害影响[18]。泡野山椒是酸性食品，其pH值范围易以游离态SO2形式的呈现，能起到良好的护色、抗氧化作用。因此，选育出具有抗逆性的耐SO2乳酸菌是改善泡野山椒品质的关键。SO2常作为防腐剂、抗氧化剂、抑菌剂广泛应用于食品行业，尤其是偏酸食品例如酱腌菜、果汁、发酵饮料[19-20]，利用乳酸菌与添加SO2结合来发酵野山椒以改善泡野山椒品质的报道甚少。目前关于耐受SO2乳酸菌的研究主要集中在果酒酿造领域。任香芸[21]等从加硫枇杷汁自然发酵的枇杷酒中分离筛选得到耐SO2的植物乳杆菌R23，可耐受120 mg/L总SO2及13%酒精。段浩云[22]等分离于自然发酵的葡萄酒中的菌株G23和L42能在酒精度13% vol、130 mg/L SO2的环境下生长，2株菌均为植物乳杆菌。
将菌株2-2、2-5以1∶1的比例混合，按照接种量2%接种，SO2添加量为75 mg/L，食盐含量4%，蔗糖含量2%在室温下发酵5 d，得到具有良好风味、金黄色泽的泡野山椒，SO2，为泡野山椒生产提供了参考数据。
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Screening, identification of sulfur dioxide-resistant lactic acid bacterium and its application in fermentation of rod chilli
ABSTRACT：Two kinds of sulfur dioxide-tolerant lactic acid bacterium were screened from garlic pickled water, and were identified to be asLactobacillus fermentum and Lactobacillus plantarum respectively based on the results of characterization of morphology, physiological and biochemical properties and 16S ribosomal DNA identification. The two strains were applied in fermentation of pickled rod chilli, and the fermentation formula for rod chili containing sulfur dioxide was optimized. Results showed that the two strains could grow well in MRS media containing 150 mg/L SO2. The optimal fermentation formula was as follows: the mixture of strain 2-2 and strain 2-5 with ratio of 1∶1 was inoculated (2%, v/w) into rod chilli sample containing 75 mg/L SO2, 4% of salt, 2% of sucrose, and then fermented at room temperature. By using the optimized fermentation formula based on these two strains, the pickled rod chilli product had golden color, extremely good taste and typical aroma. This work provides a basis for the industrial production of pickled rod chilli.
Key words：sulfur dioxide-resistant; lacticacid bacterium; identification;rod chilli;fermentation
DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609026
基金项目：四川省农业科技成果转化资金项目(14NZ0012)；四川农业大学大学生创新性科研项目
收稿日期：2016-03-21，改回日期：2016-05-24
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