被你嫌弃的它,却为科学打开了“一扇门”
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现在国际上最具有影响力的微生物组研究项目有:Human Microbiome Project (HMP)，Metagenomics of Human Intestinal Tract (MetaHIT)，Earth Microbiome Project (EMP)
随着HMP,MetaHIT,EMP的开展，科学家们积累了越来越多微生物组学的研究经验，也使得更多科研工作者投入到该领域的研究中。在人体中，肠道微生物结构最为复杂，是人类微生物组研究的焦点。基于临床资料和文献报道，本文重点讨论开展肠道微生物组研究最重要的环节，即样本采集。
1. 样本筛选
1.1 基本信息
（1）年龄：在18到65岁
（2）饮食：1周内未食用酸奶
（3）人群：该地区常住人口
（4）非孕妇，哺乳期妇女
1.2 药物
两个月内无抗生素，益生菌、益生元、合生元，铋碱式水杨酸盐药物的使用；无药物及酒精滥用
1.3 疾病
（1）胃肠道疾病：无炎症性肠病(IBD)，肠易激综合症(IBS)，胃肠炎、结肠炎或胃炎，胃肠道出血、溃疡，胃肠道息肉或包块或发育不良，其他原因的慢性或持续性便秘或者腹泻
（2）慢性及代谢性疾病：无高血压，糖尿病，心血管疾病，糖尿病，肥胖，肝硬化，脂肪肝，癌症
（3）感染：无急慢性细菌、真菌、病毒感染
（4）手术：无较大的胃肠道手术
【参考：1，11-14】
2. 材料准备
表1：耗材和仪器列表
产品 | 公司 | 货号 | 价格 | |
便盆 | Fisherbrand™ Commode Specimen Collection System | Thermo | 02-544-208 | $216.09 / Case of 60 |
采集管 | Faeces container 76x20mm（label, sterile） | Sarstedt | 80.734.311 | ¥4.4 / Case of 1 |
分装管 | Glass Bead Tubes, 0.1mm | QIAGEN | 13118-50 | $145 / Case of 50 |
试剂盒 | DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit | QIAGEN | 12855-50 或12855-100 | $274 / Case of 50 或 $514 / Case of 100 |
匀浆器 | PowerLyzer 24 Bench Top Bead-Based Homogenizer | QIAGEN | 13155 | $9,949 |
其他 | 冰，冰盒，称量仪器，分装管，自封袋，无菌牙签，-80度冰箱，一次性手套，干冰 | |||
【备注】
1. MOBIO在2017年已被QIAGEN收购
2. 试剂盒选择参考：
（1）大量的肠道微生物组学研究使用【参考:1-10】
（2）HMP，EMP protocol引用
3. 采集方法
3.1 标记
医生标记病人信息（姓名，编号，采样时间等）
3.2 准备
病人取便盆，粪便采集管，一次性手套，自封袋
3.3 粪便采集
（1）嘱咐病人先排尽尿，再用干净的便盆收集粪便，如：
【注意】避免尿液，厕所里的其他液体，纸等污染样本
（2）用粪便收集器的刮勺，取粪便内部葡萄或核桃大小（>2.5g）的粪便到收集器，如：
（3）拧上盖子，丢弃并冲走粪便，丢掉塑料袋，手套，洗手，尽快把样本交给医生
【注意】尽量减少粪便暴露在空气的时间（减少外界微生物污染，样本细菌扩增和DNA降解造成检测结果不准）；采样过程在15分钟之内完成
3.4 分装
（1）用无菌牙签挑取内部粪便到分装管，6-10管，每管0.25g
（2）完成后立即放到-80度保存
【注意】整个分装过程在冰上完成；整个采样，分装过程在30分钟之内完成
3.5 保存和转移
-80度保存，转移用干冰
4. DNA提取
4.1 DNA提取
（1）向含样本的Glass Bead Tubes加Bead Solution，用涡旋仪或匀浆器均质化样本
（2）根据试剂盒说明书提取DNA
4.3 核酸定量及保存
（1）DNA浓度测定（A260/A280：1.8-2.0），凝胶电泳鉴定
（2）20/-80度保存
参考文献：
[HMP] Product Information and Hyperlink Updates for the Human Microbiome Project (HMP) Manual of Procedures (MOP) 19 July 2012
[HMP] Manual of Procedures for Human Microbiome Project Core Microbiome Sampling Protocol A HMP Protocol # 07-001 Version Number: 12.0 29 Jul 2010
[EMP] DNA Extraction Protocol (EMP, 2011); http://www.earthmicrobiome.org/empstandard-protocols/dna-extraction-protocol/
[1] Gut microbiome remodeling induces depressive-like behaviors through a pathway mediated by the host’s metabolism. Molecular Psychiatry (2016)
[2] Synthetic long-read sequencing reveals intraspecies diversity in the human microbiome. Nat Biotechnol. 2016
[3] Capturing One of the Human Gut Microbiome's Most Wanted: Reconstructing the Genome of a Novel Butyrate-Producing, Clostridial Scavenger from Metagenomic Sequence Data. Front Microbiol. 2016
[5] Microbiota Transfer Therapy alters gut ecosystem and improves gastrointestinal and autism symptoms: an open-label study. Microbiome (2017)
[6] Structure and function of the healthy pre-adolescent pediatric gut microbiome. Microbiome. 2015
[7] Influence of early life exposure, host genetics and diet on the mouse gut microbiome and metabolome. NATURE MICROBIOLOGY 2016
[8] Dynamics of the human gut microbiome in inflammatory bowel disease. Nat Microbiol. 2017
[9] Genetic and environmental control of host-gut microbiota interactions. Genome Research 2015
[10] The severity of nonalcoholic fatty liver disease is associated with gut dysbiosis and shift in the metabolic function of the gut microbiota. Hepatology. 2016
[11] Alterations of the human gut microbiome in liver cirrhosis. Nature, 2014
[12] Metformin alters the gut microbiome of individuals with treatment-naive type 2 diabetes, contributing to the therapeutic effects of the drug. Nat Med, 2017.
[13] The Human Microbiome Project strategy for comprehensive sampling of the human microbiome and why it matters. The FASEB Journal • Research Communication 2012
[14] Altered fecal microbiota composition in patients with major depressive disorder. Brain Behav Immun, 2015
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