Notch 信号通路在银屑病发病中的作用机制研究方法

银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，其主要病理特征为角质形成细胞过度增殖，导致表皮可凋亡的角质形成细胞异常分化，并伴随皮肤炎症浸润及血管生成异常等。银屑病病程较长、易复发且较难治愈。目前关于银屑病的发病原因和机制尚无定论，但普遍认为与遗传和环境相关Notch 信号通路由多种分子及蛋白组成，参与多种疾病的发生过程，与银屑病的发生密切相关。目前研究较多的是 Notch 信号通路与免疫介导机制在银屑病发病中的作用 。角质形成细胞是构成表皮结构的主要细胞，约占表皮细胞总数的 80% 。多种皮肤肿瘤及炎症性皮肤病的发生与角质形成细胞增殖、凋亡、分化异常相关 。HaCaT 细胞是从成人皮肤中分离的永生化角质形成细胞系，其遗传特性稳定，增殖、分化特性与角质形成细胞相似，在进行实验研究时常用来替代角质形成细胞。2014 年 4月 ～ 2015 年 6 月，本研究观察 Notch 信号通路关键因子在银屑病皮损区皮肤中的表达情况及对 HaCaT

 

细胞增殖、凋亡及分化的影响，探讨 Notch 信号通路在银屑病发病中的作用机制。

 

材料与方法

 

1． 1 皮肤组织标本来源 选择同期山东省中医院就诊的斑块型银屑病患者 30 例( 病例组) ，均经皮肤组织病理检查确诊。其中男 18 例、女 12 例，年龄18 ～ 75( 32． 6 ± 7． 4) 岁。采集患者皮损区皮肤组织为病例组，同时采集距皮损区 1 cm 非皮损区皮肤组织作为对照组。纳入标准: 皮损区近 2 周未外涂药物，近 1 个月未接受免疫抑制剂及其他药物治疗。排除标准: 年龄 ＜ 18 岁或 ＞ 75 岁; 合并皮肤肿瘤或其他增生性皮肤病; 有心脑血管、肝、肾及造血系统等严重原发性疾病或其他情况不适合取材者。同期选取本院皮肤科留存的健康人皮肤组织样本 30 例作为正常组，健康人男 16 例、女 14 例，年龄 18 ～ 69

 

( 34． 2 ± 6． 8) 岁。三组性别、年龄比较差异无统计学意义( P 均 ＞ 0． 05) 。三组去除皮下结缔组织与皮下脂肪后，于液氮中速冻，－ 80 冰箱中保存备用。

 

1． 2细胞、试剂及仪器人永生化角质形成细胞系 HaCaT，购于中国科学院细胞库。Notch 信号通路特异性激活剂( Jagged1-Fc 融合蛋白) 和 Notch 信号通路特异性阻断剂( DAPT) ，购于美国 Ｒ＆D System 公司; TＲIzol、逆转录试剂盒、荧光定量试剂 ( SYBＲ Green I) ，购于日本 TaKaＲa 公司; Notch1、Jagged1、B淋巴细胞瘤 / 白血病-2 ( Bcl-2 ) 、Bcl-2 相关 X 蛋白 ( Bax) 、角蛋白 1 ( Keratin1) 和重组人外皮蛋白( In-volucrin) 单克隆抗体，购于美国 Abcam 公司; 辣根过氧化物标记的二抗，购于北京中杉金桥生物技术有限公司; DMEM 培养基、100 μg / mL 碘化丙啶( PI) 、Annexin-V-FITC，购于美国 Sigma 公司; MTT 试剂盒购于普洛麦格北京生物技术有限公司; BCA 蛋白定量试剂盒、5 × SDS 蛋白上样缓冲液，购于天根生化科技有限公司; FBS，购于杭州四季青生物工程材料研究所。CO2 培养箱，购于常州菲普实验仪器厂; 倒置显微镜，购于日本尼康; ＲT-PCＲ 仪，购于瑞士Ｒoche 公司; 流式细胞仪，购于美国 BD 公司; Multi-skan MK3 型酶标仪，购于芬兰 Thermo Labsys2tems公司。

1． 3细胞培养及处理从液氮罐中取出装有HaCaT 细胞的冻存管，放入 37恒温水浴锅中快速解冻，待细胞冻存液融解后，将细胞移至 5 mL 无菌离心管中，加入含有 10% FBS 的 DMEM 培养液

3 mL稀释冻存液中的 DMSO，1 000 r / min 离心

5 min，去除上清液。加入新的培养液吹打重悬细胞沉淀，接种到细胞培养皿中，置于 37 ，5% CO2 培养箱中培养。细胞贴壁后换液 1 次，去除漂浮的死细胞，之后定期换液，待细胞融合度达 80% 以上时，用0． 25% 的胰酶消化并收集细胞，按 1 3 的比例进行传代培养。取对数生长期的 HaCaT 细胞，去除细胞培养液，用 PBS 清洗细胞 2 次，用 0． 25% 的胰酶消化，待细胞呈单个存在时终止消化，离心收集细胞沉淀。用培养液重悬、计数后，将细胞浓度调整为 5 × 104 / mL，每孔 200 μL 接种于经紫外照射灭菌的96 孔培养板中，置于 37、5% CO2  培养箱中培养24 h后，去除细胞培养液，将细胞随机分为 Jagged1-Fc 融合蛋白组、DAPT 组、常规对照组，分别加入含 ( 终浓度 0、0． 5、1、2 μg / mL) Jagged1-Fc 融合蛋白、 ( 终浓度 0、5、10、20 μmol / L) DAPT、常规细胞培养液进行培养。

 

1． 4皮肤组织中 Notch1、Jagged1 mＲNA 表达检测

用ＲT-PCＲ 技术。取三组皮肤组织，用 TＲIzol 法提取总ＲNA。紫外分光光度计检测总 ＲNA 浓度，琼脂糖凝胶电泳检测总 ＲNA 质量; 用 PrimeScriptTM ＲTＲeagent kit 逆转录试剂盒合成将 ＲNA 逆转录成cDNA，用 ＲT-PCＲ 试剂盒检测。根据 GenBank 数据库中公布的人 Notch1 和 Jagged1 mＲNA 序列，用Primer5． 0 软件设计 ＲT-PCＲ 引物，送上海派森诺生物科技有限公司合成，引物序列为 Notch1-F: 5'-GT-CAACGCCGTAGATGACCT-3'，Notch1-Ｒ: 5'-CAGGTT-GTACTCGTCCAGCA-3';Jagged1-F:  5'-GTCCCACTG-GTTTCTCTGGA-3'，Jagged1-Ｒ:  5'-CCACAGACGTTG-GAGGAAAT-3';  β-actin-F: 5'-TGACGTGGACATCCG-CAAAG-3'，β-actin-Ｒ: 5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAG-G-3'。ＲT-PCＲ 扩增条件: 预变性 95 5 min，变性 95 30 s，退火 60 30 s，延伸 72 30 s，35 个循环。用 β-actin 作为内参，采用 2 － Ct 法计算目的基因相对表达量。

 

1． 5皮肤组织中 Notch1、Jagged1 蛋白及 HaCaT 细胞内 Bcl-2、Bax、Keratin1、Involucrin 蛋白表达检测采用 Western blotting 法。取三组皮肤组织，按照蛋白提取试剂盒说明书提取皮肤组织总蛋白; HaCaT细胞 经 Jagged1-Fc 融 合 蛋 白、DAPT 处 理。用0． 25% 的胰酶消化、收集细胞，按照蛋白提取试剂盒说明书提取 HaCaT 细胞总蛋白。按照试剂盒说明书测定组织及细胞总蛋白浓度。蛋白上清液稀释至统一浓度后，与 Loading buffer 按体积 4 1 混匀，100煮沸 5 min 使蛋白变性。将变性蛋白样品加入SDS 蛋白凝胶上样孔中，每孔 50 μL，常规方法垂直电泳。电泳结束取出蛋白凝胶，按照滤纸、PVDF膜、蛋白凝胶、滤纸的顺序在 4转膜过夜。PBST洗涤 3 次，PVDF 膜用 5% 脱脂奶粉封闭 2 h，然后依次与一抗( 500 倍稀释) 、二抗( 1 000 倍稀释) 孵育，滴加 ECL 显色液，在暗室中曝光，用 Odyssey 成像系统扫描各条带灰度值，β-actin 条带作为内参照。目的蛋白相对表达量 = 目的蛋白灰度值 / β-actin 灰度值。

 

1． 6HaCaT 细胞增殖活力检测采用 MTT 法。

HaCaT 细胞经 Jagged1-Fc 融合蛋白、DAPT 处理，置于 37 、5% CO2 培养箱中培养 24、48、72 h，每孔加入 0． 5% 的 MTT 溶液 20 μL，继续培养 4 h，弃去培养液，加入 DMSO 150 μL，低速振荡 10 min 溶解蓝紫色结晶。用空白调零孔调零，用酶标仪测定波长 570 nm 处光密度 ( A) 值，A 值与细胞数量呈正比，以 A 值作为评价细胞增殖活力的指标。

1． 7HaCaT 细胞凋亡率检测采用流式细胞术。

取对数生长期的 HaCaT 细胞分别用终浓度为 2 μg /mL 的 Jagged1-Fc 融合蛋白、终浓度为 20 μmol / L DAPT 处理 72 h，弃去细胞培养液，PBS 清洗细胞 2次，加入 0． 25% 的胰蛋白酶消化、收集细胞，以不做处理的细胞作对照。细胞计数，用细胞培养液重悬细胞，调整细胞为 1 × 106 / mL。取细胞悬液 1 mL 加入 1． 5 mL 离心管中，4，1 200 r / min，离心 5 min，弃上清液。向细胞沉淀中加入 Binding Buffer 200μL，充分混匀后分别加入 PI 5 μL 和 Annexin V-FITC 5 μL，避光室温孵育 20 ～ 30 min，加入 Binding Buffer 400 μL，用流式细胞仪检测 HaCaT 细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。

 

1． 8统计学方法采用 SPSS21． 0 统计软件。计量资料用 x珋± s 表示，比较采用单因素方差分析或重复测量方差分析，进一步两两比较采用 LSD-t 检验。P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。