缺血性脑卒中患者白细胞Homer表达水平的临床价值

• 朱满 李南迪 景伟 罗萍 涂建成 

选自中华检验医学杂志, 2017,40(4) 

缺血性脑卒中(ischemic stroke, IS)是脑卒中最常见的一种，在脑卒中发生率约为87%，是全球主要的致残性和致死性疾病，严重威胁着人类健康与生活质量^[1]。及时诊断并尽早恢复脑组织血液灌注、减轻脑组织的损害，是治疗IS的首要目标。然而，至今对于IS的治疗与干预仍然十分有限。目前，IS的诊断主要依赖于神经功能损害表现与影像学证据。由于送诊延误以及绝大多数医院不具备急诊MRI检查条件，如何在3 ～ 6 h的时间窗内快速和准确诊断IS以为后续治疗争取宝贵时间仍是临床上亟待解决的重大难题之一^[2]。1997年，Brakeman等最先描述Homer蛋白，并发现Homer具有选择性结合并调节代谢型谷氨酸受体的功能^[3]。Homer是一类细胞骨架蛋白家族，有Homer1、Homer2、Homer3三种亚型，广泛存在于脑，心脏，骨骼肌等组织中^[4]。近年研究表明，Homer参与调控细胞内多种钙通道蛋白活性，在调节细胞内钙离子浓度中发挥重要作用^[5,6,7]。本课题组先前研究^[8]显示，外周血白细胞Homer1水平在冠心病者中高表达，且与动脉粥样斑块的形成密切相关，但Homer在IS患者外周血白细胞中是否有异常表达尚未有研究报道。本研究采用实时荧光定量PCR检测IS患者外周血白细胞中Homer表达水平的变化，旨在评估白细胞Homer表达水平与疾病发生的关系，为临床IS患者的早期诊断提供新的途径和手段。

对象与方法

一、对象

收集2015年7月至2016年6月于武汉大学中南医院神经内科收治的IS患者266例，所有病例均符合中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010年标准^[9]，且经颅脑CT或MRI确诊。依据TOAST(Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment)病因分型将IS患者分为大动脉粥样硬化型(large－artery atherosclerosis，LAA)100例，腔隙性脑梗塞型(small vessel occlusion，SVO)68例，心源性栓塞型(cardioembolism，CE)42例，其他明确病因型(stroke of other demonstrated etiology，SOE)23例和不明原因型(stroke of undemonstrated etiology，SUE)33例，共5组^[10]。同期选取于中南医院体检中心进行常规体检的健康对照126名，经全身体格检查及心电图、腹部B超、X线胸片等检查及血清学肝肾功能、肿瘤标志物等检测。所有研究对象均排除急性心肌梗死及其他血管栓塞性疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病、严重的肺，肝或血液系统疾病、急性或慢性炎症性疾病。患者均签署知情同意书，标本采集经本院伦理委员会审查批准。

二、方法

1．试剂与仪器：

低温离心机(湖南湘仪集团)；CFX96荧光定量PCR仪(美国Bio－Rad公司)；逆转录试剂盒(日本Takara公司)；Trizol(日本Takara公司)；PCR仪(美国Bio－Rad公司)；荧光定量PCR引物(上海英俊生物公司)；UltraSYBR Green Mixture(江苏康为世纪公司)。

2．标本处理：

采用EDTA抗凝真空采血管收集对照者禁食12 h以上的静脉血液标本，所有卒中患者均于入院时即刻采集。所有标本均于4 ℃3 000×g离心10 min后收集血细胞，在4 ℃条件下破裂红细胞(血细胞∶裂解液＝1∶3)30 min，经4 ℃12 000×g离心10 min收集白细胞，加1 ml Trizol试剂轻轻吹打混匀后放入－80 ℃冰箱保存。

3．实时荧光定量PCR(RT－qPCR)检测白细胞Homer含量：

用Trizol试剂提取白细胞中总RNA，按照逆转录试剂盒说明书对提取RNA进行逆转录，条件为：42 ℃ 2 min去除基因组，然后37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。实时荧光定量PCR按照SYBR Green说明书进行，反应体系为：SYBR Green RT－qPCR专用预混液(SYBR Green Master Mix)10 μl，上下游引物各0.8 μl，cDNA 2 μl，去RNA酶水(DEPC水)6.4 μl。荧光定量PCR循环条件：95 °C变性5 min；95 °C 30 s，60 °C 30 s，72 °C 30 s，45个循环。Homer的相对表达量采用2^－ΔCt法进行相对定量，每组设置2个复孔。以甘油醛－3－磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase, GAPDH)为内参。RT－qPCR引物序列：Homer1上游引物：5′－GATCC TGCCTAGCCTTCT－3′，下游引物：5′－GGAGCGAG CAACCAAACG－3′；Homer2上游引物：5′－TCACCG TTTCCTACTTCTATG－3′，下游引物：5′－CCTGCGT CTTGTCTTTGG－3′；Homer3上游引物：5′－CGCAC TCACTGTCTCCTATT－3′，下游引物：5′－GGAACTT CTCGGCAAACT－3′；GAPDH上游引物：5′－AGAA GGCTGGGGCTCATTTG－3′，下游引物：5′－GCAGGAG GCATTGCTGATGAT－3′。

4．血清各生化指标测定：

血脂各项测定使用德国西门子公司ADVIA 2400全自动生化分析仪，其中总胆固醇(total cholesterol，TC)和三酰甘油(triglyceride，TG)采用酶法测定；高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL－C)及低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL－C)采用直接法测定；脂蛋白(a)[lipoprotein(a)，Lp(a)]采用比浊法；糖化血红蛋白(HbA_1c)采用免疫凝集法。

三、统计学分析

本研究属于临床病例对照研究，数据分析采用SPSS 23.0统计软件进行。P<0.05为差异有统计学意义。Homer表达水平采用－log(2^－ΔCt)表示。采用Shapiro－Wilk法检验分析数据是否符合正态分布。正态分布数据以均值 ± 标准差(s)表示，偏态数据用中位数(第25～75百分位数)[M(P₂₅～P₇₅)]表示。正态分布数据两组间比较采用两组独立样本t检验；多组间比较方差齐时采用单因素方差分析，方差不齐时采用Tamhane′s T2检验。偏态分布数据两组间比较采用Mann－Whitney U检验，多组间采用Kruskal－Wallis H检验。率或构成比间的比较采用卡方检验。多项Logistic回归分析计算Homer水平预测IS各亚型的OR值和95% CI。采用ROC曲线分析计算Homer水平判别IS各亚型的曲线下面积(area under ROC curve，AUC)及其95% CI、临界值(cut－off值)及其敏感度、特异度。

结果

一、临床基本信息

五组IS患者和健康对照者的临床特征和血清生化指标水平，见表1。各组之间年龄(F＝0.359; P＝0.876)、性别(χ²＝1.002; P＝0.563)、BMI(F＝0.853; P＝0.512)、糖尿病(χ²＝1.774; P＝0.879)、Lp(a)(χ²＝4.189; P＝0.523)、HbA_1c(F＝2.454; P＝0.063)差异无统计学意义。

表1

IS患者和健康对照者的临床特征和血清生化指标水平

与健康对照组相比，LAA、CE、SVO、SOE和SUE组的HDL－C(LAA：t＝－6.157, P<0.001；CE：t＝－4.934,P<0.001；SVO：t＝－6.830, P<0.001；SOE：t＝－4.386, P<0.001；SUE：t＝－4.521, P<0.01)水平均显著降低；LAA和SVO组的TG(LAA：Z＝－2.182, P<0.021；Z＝－3.073, SVO：P<0.001)水平显著升高；LAA、CE、SOE和SUE组的LDL－C(LAA：t＝2.720, P＝0.007；CE：t＝2.141, P＝0.036；SOE：t＝3.396, P＝0.001；SUE：t＝2.232, P＝0.030)水平显著升高；LAA组的TC(t＝4.870, P<0.001)水平显著升高。与LAA组相比，SOE组的TC(t＝－2.106, P＝0.037)与SVO组的LDL－C(t＝－2.042, P＝0.042)水平显著降低。

二、IS患者白细胞Homer表达水平

五组IS患者和健康对照者白细胞Homer相对表达水平，见表2。LAA组Homer1和Homer2水平显著高于其他病例组(Homer1：CEt＝9.353, P<0.001; SVOt＝9.258 P<0.001; SOEt＝5.396, P<0.001; SUEt＝9.644, P<0.001 Homer2: CEt＝4.725, P<0.001; SVOt＝5.545, P<0.001; SOEt＝3.640, P<0.001; SUEt＝4.669, P<0.001)和对照组(Homer1: t＝11.882, P<0.001; Homer2: t＝8.464, P<0.001)。而其他非LAA病例组及健康对照组中Homer1(F＝0.940, P＝0.441)和Homer2(F＝0.336, P＝0.854)的表达差异无统计学意义。各组间Homer3的表达差异均无统计学意义(F＝0.641, P＝0.669)。

表2

IS患者和健康对照者白细胞中Homer相对表达量[－log(2^－ΔCt)]

三、白细胞Homer1及Homer2表达与IS患者临床特征的关系

如表3所示，不同性别、年龄、BMI、吸烟史、饮酒史、高血压史、糖尿病史、高血脂史、Lp (a)、TC、TG、LDL－C、HDL－C、HbA_1c含量的患者白细胞Homer1及Homer2的表达水平差异无统计学意义(P均>0.05)。

表3

Homer1及Homer2表达量与临床特征之间的关系

四、白细胞Homer的诊断效能

ROC曲线分析显示，白细胞Homer1区分LAA与健康对照者的AUC为0.862(95% CI：0.823 ～ 0.901，P<0.001)，Cut－off值为2.195(－log)，敏感度0.75，特异度0.89(图1A)；Homer2区分LAA与健康对照者的AUC为0.760(95% CI：0.704 ～ 0.816，P<0.001)，Cut－off值为1.855(－log)，敏感度0.79，特异度0.62(图1A)；联合Homer1与Homer2区分LAA与健康对照者的AUC为0.896(95% CI：0.862～0.929，P<0.001)，敏感度0.86，特异度0.75(图1B)。白细胞Homer1区分LAA与非LAA患者的AUC为0.828(95% CI：0.779～0.878，P<0.001)，cut－off值为2.215(－log)，敏感度0.69，特异度0.91(图1C)；Homer2区分LAA与非LAA患者的AUC为0.730(95% CI：0.669～0.792，P<0.001)，cut－off值为1.895(－log)，敏感度0.75，特异度0.66(图1C)；联合Homer1与Homer2区分LAA与非LAA患者的AUC为0.847(95% CI：0.800 ～ 0.894，P<0.001)，敏感度0.76，特异度0.91(图1D)。

图1

白细胞Homer1与Homer2的诊断效能

多元Logistic回归分析以LAA、CE、SVO、SOE、SUE和健康对照组为独立的六分类变量(以健康对照组为参考类别)：单因素分析显示，白细胞高Homer1水平与LAA、SOE的发生有关，白细胞高Homer2水平与LAA的发生有关；多因素分析显示，在校正了年龄、性别、BMI、吸烟及血脂水平的影响后，白细胞Homer1和Homer2水平的升高仍与LAA的发生相关，见表4。

表4

白细胞Homer1与Homer2对IS各亚型的预测与区分价值

讨论

IS是一种异质性很强的疾病，依据发病机制不同分为五个亚型。由于不同亚型脑卒中的治疗原则不同，当IS的诊断确立之后，进一步明确其亚型将有助于治疗病因和评估预后；也更有助于针对性的开展二级预防，为个体化治疗提供依据。

钙离子作为一种重要的细胞内信使，参与多种细胞和组织的生理活动，包括胞吐，细胞凋亡及基因调控等^[11]。近期，从社区动脉粥样硬化风险(ARIC)研究的数据表明，血清钙离子浓度是引起脑卒中发生的一个独立危险因素^[12]。Kang^[13]指出，高钙血症与颅内动脉粥样硬化的存在紧密相关。这些研究表明，血液中钙离子失调可能在心脑血管疾病的发生中发挥着重要的作用。近年来，随着国内外关于Homer的研究日趋深入，其与心血管系统动脉粥样斑块发生、发展中的密切关系被逐渐揭示。Jing等^[8]发现，冠心病患者外周血白细胞Homer1表达水平较健康人显著升高。大量基础研究还发现，Homer参与调节多种钙离子调控蛋白的功能，包括代谢性谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptor，mGluR)、三磷酸肌醇受体(inositol－1，4，5－triphosphate，IP3R)、瞬时受体电位通道(transient receptor potential channel，TRPC)及兰尼碱受体(ryanodine receptors，RyRs)等^{[14,15,16,17,18]}。Jardin等^[19]的研究表明，Homer通过与钙释放激活钙通道调节分子1(calcium release－activated calcium channel modulator 1, Orai1)和基质相互作用蛋白分子1(stromal interaction molecule 1, STIM1)关联进而调节人类血小板中钙离子的内流。这些证据表明，Homer可能在动脉粥样硬化斑块发生发展中发挥重要作用，提示Homer可作为临床该类疾病的新型生物标志物。

本课题组先前的研究^[8]显示，冠心病患者白细胞Homer1水平显著升高，可作为冠心病患者早期筛查的敏感指标。国内外大量研究已证实LAA的发生与动脉粥样硬化密切相关^[20,21]。本研究发现，LAA患者外周血白细胞Homer1与Homer2水平显著升高。ROC曲线分析显示，白细胞中Homer1与Homer2对LAA的判别具有一定价值。进一步Logistic回归分析显示，在排除年龄、性别、BMI、吸烟及血脂水平的混杂因素影响后，白细胞Homer1与Homer2仍与LAA的发生有关。证实了外周血白细胞中Homer1与Homer2可作为反映血管动脉粥样斑块存在的新指标。

本研究首先发现LAA患者外周血白细胞Homer1与Homer2水平较其他IS亚型以及健康人群显著升高，外周血白细胞高Homer1与Homer2水平与LAA的发生密切相关，且具备判别LAA发生的潜在价值，有望为临床IS患者早期诊断提供新的途径与思路。

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