细胞培养过程中常见的疑惑及解答

细胞培养过程中常见的疑惑及解答  

1. 如何选用特殊细胞系培养基？ 

培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在 DMEM 或 M199 中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。 

2. 何时须更换培养基？  

视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。  

3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基？  

不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。  

4. 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？  

不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产 生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。  

5. 何谓 FBS, FCS, CS, HS ?  

FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS 乃 错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。  

6. 培养细胞时应使用 5 % 或 10% CO2？或根本没有影响？  

一般培养基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作为 pH 的缓冲系统， 而培养基中 NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的 CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7g时，细胞培养 时应使用 10 %CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5g时， 则应使用 5 % CO2 培养细胞。  

7. Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要 CO2 培养箱。原因是什么？

Hank's平衡盐溶液(HBS)和Earle's 平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？

HBS和EBS的主要差别在于碳酸氢钠的水平，在 Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L)中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles 液在空气水平的CO2中，溶液会变碱，Hanks 液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用 Eagles液；如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用 Hanks液就可以了。  

8. 细胞之接种密度为何？  

依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。  

9. 悬浮性细胞应如何继代处理？  

一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可， 若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。  

10.冷冻管应如何解冻？  

取出冷冻管后，须立即放入 37 °C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。  

11. 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除 DMSO？  

除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。  

12. 附着性细胞继代时所使用之 trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？  

一般使用之 trypsin-EDTA 浓度为 0.05%trypsin-0.53mMEDTA-4Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20 °C，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低， 并可减少污染之机会。  

13.欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？  

欲回收动物细胞， 其离心速率一般为 300xg (约 1,000rpm)，5 - 10 分钟，过高之转速，将造成细胞死亡。  

14. 细胞冷冻培养基之成份为何？  

动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10%DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于 DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将 DMSO 直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。  

15.DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？  

冷冻保存使用之 DMSO 等级，必须为Tissue culture grade之DMSO (如 Sigma D2650)，其本 身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于 4°C，避免反复冷冻解冻造成 DMSO 之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。若要过滤 DMSO，则须使用耐 DMSO 之 Nylon 材质滤膜。  

16.冷冻保存细胞之方法？  

冷冻保存方法一: 冷冻管置于 4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽 vaporphase 长期储存。  

冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降 1-3 °C 至–80 °C 以下，再放入液氮槽 vapor phase 长期储存。-20 °C 不可超过 1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。  

17. 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？  

冷冻管内细胞数目一般为 1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以 5x10^6 cells/ml vial 为宜。  

18.培养基中是否须添加抗生素？  

除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。  

19.应如何避免细胞污染？  

细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。  

20.如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？  

原则上：直接灭菌后丢弃之。当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查 HEPA 过滤器。高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素 B 和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。

 下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。

①在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。②分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加 入到每一个孔中。例如，两性霉素 B 推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

③每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。

④确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度 2～3 倍浓度的抗生素的培养液培养细胞 2～3 代。

⑤在无抗生素的培养基中培养细胞一代。

⑥重复步骤 4。

 ⑦在无抗生素的培养基中培养 4～6 代，确定污染是否以已被消除。  

21.支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？  

不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。

22.支原体污染会对细胞培养有何影响？  

支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数， 代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确 认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。  

23. 侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？  

直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。  

24. CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？  

定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。  

25.为何培养基保存于 4 °C 冰箱中，颜色会偏暗红色，且 pH 值会越来越偏碱性？ 

培养基保存于 4 °C 冰箱中， 培养基内之 CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为 phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时， 可以通入无菌过滤之 CO2， 以调整 pH 值。  

26. 各种细胞培养用的 dish，flask 是否均相同？  

不同厂牌的 dish 或 flask， 其所 coating 的 polymer 不同， 制造程序亦不同， 虽对大部分细胞 没有太大之影响， 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之 dish 或 flask 而有显著之生长差异。  

27. 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？  

研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心， 应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。  

28.购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？  

研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心.悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80 °C 太久。 

29.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？  

L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。  

30.GlutaMAX-I 是什么？

培养细胞如何利用 GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？  GlutaMAX-I 二肽是一个 L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的 alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放 L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在 121 磅灭菌20 分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解， 如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。  

31.什么培养基中可以省去加酚红？  

酚红在培养基中用作 PH 值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不 使用加有酚红的培养基。